浅谈层析实验中的气泡问题（三）

更新时间：2022-07-19

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那么下面上海金鹏分析仪器有限公司为大家简单介绍一下浅谈层析实验中的气泡问题（三）：

说到气泡，你可能会联想到酣畅淋漓的可乐，通透上头的啤酒，亦或是流光飞舞的浪漫，生活中的气泡，似乎还带有那么一丝美好，然而对于实验来说，尤其是在大多不会配置在线脱气单元的FPLC系统上做的层析实验，气泡就如烦人的苍蝇，鞋里的石子，令人如鲠在喉不吐不快，如若是重要样品、昂贵填料，气泡带来的实验失败那简直是小型灾难现场。那么气泡是源自何来，而又去之何处，怎么能让它们从我们的系统里消失，以下此篇，做一个小小探讨，抛砖引玉，共谋对策而灭之。

关于气泡来源，正如病从口入，无非就是进入系统的开口处：流动相，或者流路中相对负压处的漏点；如果流动相脱气不理想或仪器本身连接管路、组件存在问题，流路中将形成肆意妄为的气泡，引发一系列问题：

1. 组分峰面积变化，峰形变化；

2. 形成尖峰或锯齿状噪声；

3. 出现鬼峰，基线漂移波动增大；

4. 泵动作失常，压力波动，检测基线全抖；

5. 填料走空，干柱；

6. 溶解氧可能氧化样品组分和（或）流动相及固定相组分，使检测失真。

实际案例

Fig.1 气泡造成的UV杂峰

Fig.2 气泡造成的系统压力波动

这些症状基本能覆盖大部分的层析实验问题，可见气泡的破坏力和恼人程度，知己知彼方才能有的放矢，那么气泡是如何形成的呢？流动相中气体形成的原因有多种，*根本的还是由于气体在液体中达到过饱和状态；平衡状态时溶解空气的量与溶液的性质、气体的种类有关，也与外界条件有关, 主要的外界条件有以下 3 种。

溶

剂

混

合

气体的溶解量与气体的种类有关，也与溶剂的种类有关。通常极性低的气体容易溶解于低极性的溶剂，极性高的气体容易溶解于高极性的溶剂。通常当两种不同的溶剂混合时，混合溶剂中溶解的空气量也将发生变化。大量实验证明：混合溶剂中溶解的空气量比各个纯溶剂的空气溶解量要小。

● 配置缓冲液时，大多会进行不同液体的混合，液体热力学体积的变化，和放热吸热，都会产生气泡，如配置20%乙醇溶液，酸溶液，盐溶液，乙腈溶液，会明显有气泡产生，此时就需要对溶液进行静置或脱气操作，才可用于实验。

● 在层析实验中，有很多溶液混合的操作，如置换缓冲，洗脱等等，所以一些溶液的混合需要尽量避免，比如乙醇溶液和盐溶液，需要用纯水隔开，否则易造成气泡析出，所以当乙醇溶液保存的系统需要进行实验时，缓冲液是盐溶液如PBS，我们就需要用纯水先做系统冲洗，再做PBS的填充。

Fig.4 缓冲液中析出的气泡

●如果实验设计中，不可避免的需要两种不同极性溶剂的混合，还要避免气泡，则需要从混合处想办法，一般的层析系统两相溶剂的混合是在有搅拌装置的动态混合池中进行，混合剧烈，容易析出气泡，此时可以考虑将动态混合器改为静态混合器，让溶剂的混合方式由剧烈变为温和，会有较好的避免气泡的效果。

Fig.5 动态混合器和静态混合器

另外，除了溶液带入，系统中的漏点也会引入气泡，尤其是未加压的低压流路，在管路接头、阀和转子等分离结构位置，容易产生漏点，系统中如果发现有气泡造成基线波动，而在溶液进口又没发现可见的气泡，则需要在系统内查找漏点，有效的办法是用透明的ETFE管代替不透明的Peek管，观察是哪一段出现的气泡，以便判断漏点，及时处理。

Fig.6 管路中漏入的气泡

关于溶剂的脱气方法，目前常用的有两种：超声脱气和负压脱气；超声脱气就是利用超声锅或者超声探头，当高功率超声波耦合到液体中时，液体分别在高压和低压循环中被压缩和膨胀，在低压循环中，会产生微小的真空气泡（所谓的空化气泡），这些气泡会在多个压力循环中增长。在气泡生长的那些周期中，液体中的溶解气体进入真空气泡，这样真空气泡就变成了不断增长的气泡。超声脱气特点是操作便捷，效率高，脱气快，一般10-15分钟的超声可以去除溶液中大部分气泡，缺点是容易发热，需要降温，注意在用超声锅脱气时，溶剂瓶盖要拧松或者拿掉；负压脱气是利用机械产生负压的方式使溶液中的气泡析出，一般分析型色谱仪或者需要高精度检测的仪器，在流路中配置在线脱气单元，都是利用负压的原理进行脱气，实验室常用的是真空抽滤装置，既能过滤溶液，又能脱气，实用性高。

Fig.7 超声脱气

Fig.8 真空抽滤装置

如果层析系统的流路里混入了气泡，首先是要进行大流速的system wash，可吹扫出大部分的气泡，然而有些微小气泡仍然是不容易冲出的，在可见透明管中的细微气泡可用外力敲打让其脱离管路内壁而冲出，但是系统内部，尤其是泵腔，单向阀，检测器流通池内的细微气泡，不可视，也不能外力敲打，所以无法判断是否冲洗*，滞留在柱塞泵单向阀或者检测器流通池的微小气泡仍然会给层析图谱带来波动影响，此时我们可以使用无水甲醇或乙醇来做system wash，*好加一定的反压，因为甲醇或乙醇试剂降低了气-液界面张力,甲醇（乙醇）分子不能形成坚固的膜,于是气泡破裂或者从流路内壁脱落，从而带出了流路中的各种细微气泡，达到系统脱气的目的；而另一方面，系统内部流路的清洁程度也是影响气泡滞留的重要原因，FPLC系统经常会过复杂的生物质样品，如果日常冲洗不充分，流路内壁容易形成脏污，会增加对微小气泡的顽固吸附，影响实验，因此定期的系统全*面清洗，对于排除气泡也是至关重要。

总而言之，对于快速制备型色谱层析，气泡固然是一个人人喊打的不稳定因素，但我们如果了解原因，准备充分，方法得当，气泡也是可以从系统中*赶走，让实验更加流畅，让图谱更加平滑，让珍贵样品上乘分离，让昂贵填料物尽其用。

以上就是上海金鹏分析仪器有限公司为大家整理总结关于浅谈层析实验中的气泡问题（三）。
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